摘 要： 本研究以蘆丁為對照品, 建立了三氯化鋁比色法測定稻殼中總黃酮含量的分析方法。系統(tǒng)考察了顯色劑濃度及用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等因素對總黃酮測定值的影響。結(jié)果表明, 三氯化鋁比色法測定稻殼中總黃酮含量的最優(yōu)條件為:1mL的稻殼提取液中加入1mL質(zhì)量濃度為2.0%三氯化鋁溶液, 30%乙醇定容至10mL, 不避光條件下于35℃水浴反應(yīng)5min, 279nm處測定吸光度。該法穩(wěn)定性好、回收率高, 適用于稻殼中總黃酮含量的測定。

隨著農(nóng)作物新型栽培技術(shù)的推廣及農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化推進(jìn)步伐的加快, 我國的水稻產(chǎn)量已達(dá)2億t以上, 即每年可產(chǎn)生0.4億t左右的稻殼[1], 面對如此數(shù)量龐大的稻殼生物質(zhì)資源, 若能加以綜合利用, 制備出系列高附加值產(chǎn)品, 形成完整的生物質(zhì)循環(huán)產(chǎn)業(yè)鏈, 這對于變廢為寶, 緩解環(huán)境壓力, 實(shí)現(xiàn)農(nóng)民財(cái)富增收具有重要意義。

稻殼已被發(fā)現(xiàn)富含黃酮類等天然活性成分, 而黃酮類化合物具有抑菌抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等多種藥理及保健作用[2,3], 市場前景極為廣闊。人們已采用各種方法對對稻殼中總黃酮進(jìn)行了提取, 然而對其含量測定分析的研究報(bào)道較少。已有文獻(xiàn)中對稻殼黃酮含量的分析, 多采用《中國藥典》中的NaNO2-Al (NO3) 3-NaOH比色法, 該法被發(fā)現(xiàn)對一些植物黃酮含量分析時(shí)專屬性不強(qiáng)[4,5]。本研究以蘆丁為對照品, 采用三氯化鋁比色法測定稻殼中總黃酮的含量, 并對各種顯色條件進(jìn)行了考察, 建立了一種稻殼中總黃酮含量測定的方法, 以期為稻殼黃酮的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

稻殼 (市售) ;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 (上海伊卡生物技術(shù)有限公司) ;無水乙醇、三氯化鋁、Na OH、HCl, 國產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司) ;XA-1微型高速粉碎機(jī) (姜堰市銀河儀器廠) ;KQ5200DE超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司) ;DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司) ;80-2臺式離心機(jī) (上海浦東物理光學(xué)儀器廠) 。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取100℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品18mg于50m L的燒杯中, 加入適量無水乙醇溶液, 常溫下超聲處理5min, 待蘆丁全部溶解后轉(zhuǎn)移至100m L的容量瓶中, 用30%乙醇溶液定容, 配成0.18mg·m L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精密移取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L分別置6支25m L的比色管內(nèi), 加入10m L 0.1%三氯化鋁溶液, 用30%乙醇定容至刻度, 搖勻, 于室溫靜置10min后測定吸光度, 并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蘆丁對照品濃度C (mg·m L) 為橫坐標(biāo), 吸光度A為縱坐標(biāo), 得回歸方程為A=38.921C+0.0084, R=0.9993。

1.3.2 稻殼中總黃酮的提取

稻殼洗去雜質(zhì)后低溫烘干, 粉碎過50目的篩。精確稱取10g稻殼粉, 經(jīng)石油醚浸泡24h, 過濾, 濾渣加入200m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液, 于室溫下超聲提取0.5h, 過濾。濾渣以同樣方法再次超聲提取并抽濾, 濾液合并后于55℃下減壓濃縮并定容于100m L的容量瓶中, 低溫貯藏備用。

1.3.3 稻殼黃酮的紫外-可見光譜掃描

三氯化鋁比色法:移取1m L稻殼黃酮粗提液置10m L容量瓶中, 加入0.1%的三氯化鋁-30%乙醇溶液4m L, 30%的乙醇定容至刻度, 靜置10min后, 以試劑空白參比, 在200~550nm區(qū)間進(jìn)行光譜掃描。

1.3.4 顯色條件的優(yōu)化

1.3.4. 1 三氯化鋁加入量

精密移取0.5m L稻殼提取液到10m L容量瓶內(nèi), 加入不同體積 (1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L) 0.1%三氯化鋁溶液, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于30℃水浴中反應(yīng)10min, 于279nm測定吸光度值。

1.3.4. 2 三氯化鋁濃度

精密移取1m L稻殼提取液到10m L容量瓶內(nèi), 加入不同質(zhì)量濃度0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%三氯化鋁溶液, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于30℃水浴中反應(yīng)10min, 于279nm測定吸光度值。

1.3.4. 3 反應(yīng)溫度

精密移取1m L稻殼提取液到10m L容量瓶內(nèi), 加入濃度為2.0%三氯化鋁溶液1m L, 30%的乙醇定容至刻度, 再分別置于不同溫度20、25、30、35、40、45℃水浴中反應(yīng)10min, 于279nm測定吸光度值。

1.3.4. 4 反應(yīng)時(shí)間

精密移取1m L稻殼提取液到10m L容量瓶內(nèi), 加入濃度為2.0%三氯化鋁溶液1m L, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于35℃水浴中分別反應(yīng)5、10、15、20、25、30min, 于279nm測定吸光度值。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密移取1m L稻殼提取液到10m L容量瓶內(nèi), 加入濃度為2.0%三氯化鋁溶液1m L, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于35℃水浴中反應(yīng)5min后取出, 每間隔10min測定吸光度值, 計(jì)算RSD值。

1.3.6 精密度試驗(yàn)

取6個(gè)10m L容量瓶, 分別依次加入1m L稻殼提取液、1m L 2.0%三氯化鋁溶液, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于35℃水浴中反應(yīng)5min, 測定吸光度并計(jì)算RSD值。

1.3.7 回收率試驗(yàn)

精密移取1m L稻殼提取液到10m L容量瓶內(nèi), 加入稀釋蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1m L, 濃度為2.0%三氯化鋁溶液1m L, 30%的乙醇定容至刻度, 再置于35℃水浴中分別反應(yīng)5min, 測定吸光度并考察方法的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

圖1 蘆丁和稻殼黃酮紫外可見吸收光譜圖

從圖1可以看出, 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在272.5nm、417nm處各有一個(gè)吸收峰, 稻殼黃酮提取液則在279nm處具有吸收峰。279nm處稻殼黃酮和蘆丁的吸收峰近似吻合, 可以選擇279nm處進(jìn)行稻殼黃酮含量的測定。

2.2 顯色條件的優(yōu)化

2.2.1 三氯化鋁用量的選擇

圖2 三氯化鋁用量的選擇

由圖2可見, 隨著Al Cl3使用量的增加, 吸光度值迅速增大, 在加入量為1m L時(shí)便達(dá)到最大值, 此后再增大Al Cl3加入量, 吸光度值呈下降趨勢并逐漸趨于穩(wěn)定, 從經(jīng)濟(jì)角度分析Al Cl3體積選擇1m L即可。

圖3 三氯化鋁濃度的選擇

由圖3可見, 隨著三氯化鋁濃度的增加, 吸光度值快速增加, 在濃度為2.0%時(shí)達(dá)到最大值, 此后再增大三氯化鋁濃度, 吸光度值隨后緩慢下降, 因此, 適宜的三氯化鋁濃度選擇2.0%。

2.2.3 反應(yīng)溫度的選擇

圖4 三氯化鋁反應(yīng)溫度的選擇

由圖4可見, 隨著三氯化鋁反應(yīng)溫度的升高, 吸光度值緩慢升高, 在溫度為35℃時(shí)達(dá)到最大值, 因此, 適宜的三氯化鋁反應(yīng)溫度選擇35℃。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的選擇

圖5 三氯化鋁反應(yīng)時(shí)間的選擇

由圖5可見, 隨著三氯化鋁反應(yīng)時(shí)間的增加, 在5~20min吸光度值穩(wěn)定, 水浴時(shí)間再延長吸光度呈一定下降趨勢, 因此, 適宜的三氯化鋁反應(yīng)時(shí)間選擇5min。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知, 此測定方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.687%, 因此稻殼黃酮溶液中加入三氯化鋁顯色后在60 min內(nèi)顯色較穩(wěn)定, 因此測定時(shí)控制在60min內(nèi)完成。

2.4 精密度試驗(yàn)

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可見, 精密度實(shí)驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.400%, 因此, 該方法測定的精密度在誤差范圍內(nèi), 用該法測定稻殼中總黃酮, 精密度良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知, 該方法測定稻殼中總黃酮含量, 加標(biāo)回收率為100.05%, 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.770%, 因而該方法具有較高的回收率。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用三氯化鋁比色法測定稻殼提取物總黃酮的含量, 并對測定條件進(jìn)行了優(yōu)化, 優(yōu)化后的工藝條件為:反應(yīng)溫度35℃、反應(yīng)時(shí)間5 min、顯色劑加入量1m L、顯色劑質(zhì)量濃度2.0%, 此條件下可成功地用于稻殼提取物中總黃酮的定量分析, 該測定方法穩(wěn)定性好、精密度及回收率較高。

參考文獻(xiàn)

[1]孫慶文, 許珂敬, 郭彥青.高活性稻殼灰的制備、提純及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國陶瓷, 2012, 48 (7) :1-5.

[2]關(guān)海寧, 喬秀麗, 刁小琴, 等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取稻殼中黃酮的工藝研究[J].食品工業(yè), 2013, 34 (7) :67-70.

[3]萬明, 宋永鋼, 楊菠.黃酮類化合物的藥理作用及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].江西食品工業(yè), 2007, (3) :47-49.

[4]何珺, 顏仁梁, 劉志剛.Na NO2-AL (NO3) 3-Na OH比色法測定總黃酮應(yīng)用中的常見問題[J].今日藥學(xué), 2009, 19 (12) :18~21.

[5]鄭有飛, 石春紅.天然黃酮物質(zhì)提取技術(shù)和分析方法的研究進(jìn)展[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 25 (1) :102~107.

作者簡介：宗春燕 (1976-) , 女, 講師, 碩士研究生, 2006年畢業(yè)于中國礦業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)專業(yè), 主要從事精細(xì)化學(xué)品的制備與工藝研究。